牡丹復(fù)色花瓣顯色機理研究

第1章緒論/001
1.1植物花色與花青苷/003
1.1.1植物花色的形成機理/003
1.1.2花青苷的結(jié)構(gòu)與種類/004
1.1.3花青苷的理化性質(zhì)/005
1.1.4花青苷的生理和生物功能/005
1.2花青苷的生物合成及基因調(diào)控/006
1.2.1花青苷的生物合成途徑/006
1.2.2花青苷合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因/007
1.2.3調(diào)控花青苷合成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子/012
1.2.4與花青苷合成調(diào)控相關(guān)的miRNA/014
1.3RNA-seq技術(shù)/017
1.4植物復(fù)色花顯色機理的研究進展/018
1.5牡丹花色形成及差異機理的研究進展/022

第2章牡丹復(fù)色花瓣顯色生理機理研究/027
2.1牡丹復(fù)色花瓣的花色指數(shù)/028
2.1.1花色指數(shù)的測試方法/028
2.1.2花色指數(shù)的測定分析/028
2.2牡丹復(fù)色花瓣中的可溶性糖含量/028
2.2.1可溶性糖含量的測試方法/028
2.2.2可溶性糖含量的測定分析/029
2.3牡丹復(fù)色花瓣中的液泡pH值/030
2.3.1液泡pH值的測試方法/030
2.3.2液泡pH值的測定分析/030
2.4牡丹復(fù)色花瓣中的金屬元素含量/031
2.4.1金屬元素含量的測試方法/031
2.4.2金屬元素含量的測定分析/031
2.5牡丹復(fù)色花瓣中的花青苷組成和含量/033
2.5.1花青苷組成和含量的測試方法/033
2.5.2花青苷組成和含量的測定分析/033
2.6牡丹復(fù)色花瓣中的黃酮、黃酮醇組成和含量/035
2.6.1黃酮、黃酮醇組成和含量的測試方法/035
2.6.2黃酮、黃酮醇組成和含量的測定分析/036
2.7牡丹復(fù)色花瓣的上表皮細胞形狀/037
2.7.1上表皮細胞形狀的測試方法/037
2.7.2上表皮細胞形狀的觀察分析/038
2.8牡丹復(fù)色花瓣的花色與主要生理指標的相關(guān)性分析/038

第3章牡丹復(fù)色花瓣顯色分子機理研究/041
3.1牡丹復(fù)色花瓣的轉(zhuǎn)錄組測序（mRNA-seq）/042
3.1.1轉(zhuǎn)錄組測序所用總RNA的提取/042
3.1.2轉(zhuǎn)錄組測序與De novo組裝/044
3.1.3unigene的功能注釋與分類/046
3.1.4差異表達基因的分析/051
3.1.5牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)基因的熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證/054
3.2牡丹復(fù)色花瓣顯色相關(guān)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因PsDFR的克隆及序列分析/057
3.2.1牡丹復(fù)色花瓣中PsDFR基因cDNA全長的克隆/058
3.2.2牡丹復(fù)色花瓣中PsDFR基因組DNA全長的克隆/062
3.2.3牡丹復(fù)色花瓣中PsDFR啟動子區(qū)域的克隆/065
3.2.4牡丹復(fù)色花瓣中PsDFR啟動子區(qū)域甲基化水平的測定/070
3.3牡丹復(fù)色花瓣的小RNA測序（sRNA-seq）/072
3.3.1小RNA測序所用總RNA的提取/072
3.3.2小RNA文庫構(gòu)建和測序/074
3.3.3牡丹復(fù)色花瓣中miRNA的鑒定及靶基因的預(yù)測/076
3.3.4miRNA的差異表達分析/078
3.3.5差異表達miRNA靶基因的功能富集/078
3.3.6牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的差異表達miRNA/081
3.3.7牡丹復(fù)色花瓣小RNA測序結(jié)果的熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證/081
3.4牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的篩選/083
3.4.1MYB家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選/083
3.4.2bHLH家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選/085
3.4.3WD40和SPL家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選/085
3.5牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因的克隆及功能驗證/087
3.5.1牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因全長的克隆/087
3.5.2牡丹PsMYB114L和PsMYB12L蛋白的生物信息學分析/088
3.5.3牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因的時空表達模式分析/094
3.5.4牡丹PsMYB114L和PsMYB12L蛋白的亞細胞定位/095
3.5.5牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因在擬南芥中的功能驗證/099
3.5.6牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因在蘋果愈傷組織中的功能驗證/107
3.6牡丹PsMYB114L、PsMYB12L對PsDFR基因啟動子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性的驗證/112
3.6.1牡丹PsMYB114L、PsMYB12L與PsDFR啟動子結(jié)合的酵母單雜交驗證/112
3.6.2牡丹PsMYB114L、PsMYB12L對PsDFR啟動子激活的雙熒光素酶報告驗證/115

第4章牡丹復(fù)色花瓣顯色機理初步解析/119
4.1牡丹復(fù)色花瓣顯色相關(guān)的關(guān)鍵生理原因/120
4.2牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的關(guān)鍵基因的初步確定/121
4.2.1基于轉(zhuǎn)錄組測序篩選與牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的差異表達基因/121
4.2.2牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的初步確定/122
4.2.3牡丹復(fù)色花瓣中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因PsDFR的克隆和序列比對/123
4.2.4基于小RNA測序篩選與牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的差異表達miRNA/124
4.2.5牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的初步確定/126
4.3牡丹花瓣復(fù)色形成相關(guān)的關(guān)鍵基因的功能研究/127
4.3.1牡丹關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PsMYB114L和PsMYB12L的克隆及過表達/127
4.3.2牡丹PsMYB114L、PsMYB12L對PsDFR基因調(diào)控的驗證/130

附錄本研究相關(guān)基因的引物序列/131

參考文獻/138