輪狀病毒VP7基因植物表達(dá)技術(shù)研究

第1 章　輪狀病毒研究概況　1
1.1 輪狀病毒的危害 3
1.2 輪狀病毒的基本特性 4
1.3 輪狀病毒蛋白特征 5
1.4 輪狀病毒的血清學(xué)分類 8
1.5 輪狀病毒疫苗的發(fā)展概況 9
1.6 輪狀病毒疫苗的效果和有效性 15

第2 章　植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白研究進(jìn)展及霍亂毒素B 亞基（CTB） 與連接肽介紹　17
2.1 植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白概況 19
2.2 植物生產(chǎn)藥用蛋白的優(yōu)勢(shì)和面臨的挑戰(zhàn) 24
2.3 植物生產(chǎn)藥用蛋白的技術(shù)平臺(tái) 27
2.4 植物生產(chǎn)疫苗 31
2.5 霍亂毒素 B 亞基（CTB）與連接肽 39

第3 章　輪狀病毒外殼蛋白VP7 在原核中表達(dá)的研究　43
3.1 原核表達(dá)材料和儀器設(shè)備 45
3.2 HRVVP7 基因序列合成及克隆載體構(gòu)建 51
3.3 構(gòu)建 pET-22b-HRVVP7 原核表達(dá)載體 55
3.4 HRVVP7 原核表達(dá)條件優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物的存在形式 61
3.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 64
3.6 HRVVP7 純化 65
3.7 免疫印跡法檢測(cè) 66
3.8 基因序列合成及克隆載體構(gòu)建結(jié)果 67
3.9 pET-22b-HRVVP7 原核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果 72
3.10 HRVVP7 原核表達(dá)條件優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物的存在形式結(jié)果 73
3.11 HRVVP7 純化結(jié)果 75
3.12 蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果 77

第4 章　擬南芥表達(dá)輪狀病毒外殼蛋白VP7 的研究　83
4.1 擬南芥表達(dá)實(shí)驗(yàn)材料及儀器準(zhǔn)備 86
4.2 構(gòu)建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表達(dá)載體 90
4.3 轉(zhuǎn)化擬南芥與篩選 97
4.4 轉(zhuǎn)化擬南芥的分子生物學(xué)檢測(cè) 101
4.5 HRVVP7-linker-CTB 核酸序列合成及優(yōu)化結(jié)果 103
4.6 PCR 擴(kuò)增 HRVVP7 核酸序列結(jié)果 105
4.7 pEASY -T1-HRVVP7 載體構(gòu)建結(jié)果 107
4.8 構(gòu)建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表達(dá)載體結(jié)果 107
4.9 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定 110
4.10 擬南芥陽性植株的篩選 111
4.11 轉(zhuǎn)基因擬南芥在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)分析 113
4.12 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果 114
4.13 蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果 115
4.14 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定分析外源蛋白的表達(dá)量 116

第5 章　紅花種子表達(dá)輪狀病毒外殼蛋白VP7 的研究　123
5.1 紅花表達(dá)實(shí)驗(yàn)材料及試劑準(zhǔn)備 125
5.2 pPhaP3301-HRVVP7 質(zhì)粒凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 127
5.3 紅花的遺傳轉(zhuǎn)化 127
5.4 抗性苗嫁接 128
5.5 轉(zhuǎn)基因植株的基因組 PCR 鑒定 129
5.6 BCA 法測(cè)定紅花種子中總蛋白濃度 130
5.7 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)紅花種子中 HRVVP7 蛋白的表達(dá) 131
5.8 蛋白免疫印跡檢測(cè)紅花種子中 HRVVP7蛋白的表達(dá) 131
5.9 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定檢測(cè)紅花種子中HRVVP7 蛋白的表達(dá)水平 132
5.10 轉(zhuǎn)基因紅花苗的獲得 132
5.11 轉(zhuǎn)基因紅花葉片 PCR 檢測(cè)結(jié)果 133
5.12 BCA 測(cè)定總蛋白 134
5.13 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)種子蛋白表達(dá)結(jié)果 135
5.14 蛋白免疫印跡檢測(cè)種子蛋白表達(dá)結(jié)果 136
5.15 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定檢測(cè)種子蛋白表達(dá)水平 137

第6 章　轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的免疫學(xué)檢測(cè)　141
6.1 免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)材料及儀器準(zhǔn)備 143
6.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株總蛋白量測(cè)定 145
6.3 動(dòng)物免疫 146
6.4 小鼠產(chǎn)生 HRVVP7 抗體效價(jià)測(cè)定 146
6.5 抗體中和實(shí)驗(yàn) 148
6.6 乳鼠攻毒實(shí)驗(yàn) 149
6.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 150
6.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子總蛋白提取與蛋白含量測(cè)定 151
6.9 小鼠免疫后產(chǎn)生 HRVVP7 抗體效價(jià)測(cè)定 153
6.10 HRVVP7 抗體中和病毒效果分析 158
6.11 乳鼠攻毒后觀察統(tǒng)計(jì) 160

參考文獻(xiàn)　169

附錄　輪狀病毒相關(guān)知識(shí)簡(jiǎn)介　183