CRISPR基因編輯技術

第1章　CRISPR-Cas系統(tǒng)概述 001
1.1　引言 002
1.2　CRISPR-Cas分類 003
1.3　2類CRISPR-Cas系統(tǒng) 004
1.4　CRISPR-Cas系統(tǒng)的遞送方法 005
1.5　CRISPR-Cas系統(tǒng)的非基因組編輯方法 005
1.5.1　用CRISPR-Cas13和rCas9靶向RNA 005
1.5.2　CRISPRa/CRISPRi、表觀遺傳修飾和標記 006
1.6　CRISPR-Cas商業(yè)化現(xiàn)狀 007
1.7　結語 007
參考文獻 008

第2章　基因編輯技術史話 011
2.1　引言 012
2.2　基因編輯技術的歷史先河：基因打靶技術 012
2.3　曇花一現(xiàn)：鋅指核酸酶技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶技術 015
2.4　革命時代的來臨：CRISPR技術 018
2.5　結語 021
參考文獻 022

第3章　基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯技術的進展 025
3.1　引言 026
3.2　基因編輯技術的發(fā)展 026
3.3　CRISPR-Cas系統(tǒng)的多樣性、分類與演變 028
3.3.1　CRISPR-Cas系統(tǒng)分類及作用原理 028
3.3.2　CRISPR-Cas系統(tǒng)的源起和進化 029
3.4　CRISPR-Cas系統(tǒng)的應用進展 031
3.4.1　在細菌及古菌中的應用 031
3.4.2　在真菌中的應用 032
3.4.3　在植物細胞中的應用 033
3.4.4　在動物細胞中的應用 034
3.5　CRISPR-Cas系統(tǒng)的前瞻性應用 035
3.6　結語 037
參考文獻 037

第4章　CRISPR-Cas9的結構和作用機制 043
4.1　引言 044
4.2　CRISPR-Cas9生物學 044
4.3　Cas9酶 046
4.3.1　Apo酶的雙葉結構 046
4.3.2　HNH和RuvC核酸酶結構域 047
4.4　CRISPR-Cas9效應復合物的組裝 047
4.4.1　sgRNA結合后的構象重排 048
4.4.2　Cas9與sgRNA的相互作用 048
4.4.3　預排序種子RNA以及Cas9與PAM的相互作用 049
4.5　目標搜索與識別 049
4.5.1　RNA-DNA異源雙鏈 050
4.5.2　PAM識別 051
4.5.3　局部DNA熔解和R環(huán)形成 051
4.5.4　Cas9誘導的DNA彎曲 053
4.6　靶標切割 053
4.6.1　解偶聯(lián)的DNA結合和切割事件 054
4.6.2　通過HNH-RuvC通訊進行DNA協(xié)同切割 054
4.6.3　非靶DNA鏈在HNH重定位中的關鍵作用 055
4.7　CRISPR-Cas9介導的DNA靶向和切割模型 056
4.8　Cas9直系同源物的結構 056
4.9　結語 057
參考文獻 058

第5章　CRISPR介導的表觀遺傳學編輯 063
5.1　引言 064
5.2　針對組蛋白的表觀修飾 065
5.2.1　轉錄激活 065
5.2.2　轉錄抑制 066
5.2.3　目前的局限性 067
5.2.4　克服當前局限性 069
5.3　針對DNA的表觀修飾研究 070
5.3.1　DNA甲基化 070
5.3.2　DNA去甲基化 071
5.3.3　使用CRISPR介導的方法探測新的DNA表觀遺傳修飾 072
5.3.4　m5dC衍生物的氧化 072
5.3.5　N6-甲基脫氧腺苷的發(fā)現(xiàn) 072
5.3.6　發(fā)現(xiàn)新的DNA表觀遺傳修飾 073
5.4　針對非編碼RNA的表觀遺傳學功能 074
5.5　化學和光誘導基因組表觀編輯 075
5.6　表觀基因組編輯與病理和醫(yī)療 076
5.7　超越CRISPR-Cas9 077
5.8　結語 078
參考文獻 080

第6章　CRISPR-Cas9的脫靶效應 089
6.1　引言 090
6.2　最小化CRISPR-Cas9系統(tǒng)脫靶效應的策略 091
6.2.1　改善sgRNA-Cas9復合物的有效濃度和sgRNA-Cas9復合物遞送 091
6.2.2　sgRNA分子的合理設計 093
6.2.3　新的Cas9變體的合理工程設計 094
6.2.4　Cas9直系同源物 095
6.2.5　Ⅱ類Cas9直系同源物 096
6.3　CRISPR-Cas9系統(tǒng)中脫靶效應的檢測方法 098
6.3.1　預測的脫靶位點檢測 099
6.3.2　WGS 099
6.3.3　ChIP-seq 099
6.3.4　IDLV捕獲 100
6.3.5　BLESS 100
6.3.6　GUIDE-seq 101
6.3.7　LAM-HTGTS 101
6.3.8　Digenome-seq 102
6.3.9　SITE-seq 102
6.3.10　CIRCLE-seq 103
6.3.11　GOTI 103
6.3.12　PEM-seq 104
6.3.13　DISCOVER-seq 104
6.4　結語 105
參考文獻 105

第7章　CRISPR-Cas9的實驗模型 112
7.1　引言 113
7.2　細胞模型 114
7.3　動物模型 118
7.3.1　鼠 118
7.3.2　果蠅 120
7.3.3　斑馬魚 121
7.3.4　豬 123
7.3.5　其他動物模型 123
7.4　植物 125
7.5　真菌 127
7.6　細菌 129
7.7　結語 133
參考文獻 133

第8章　納米材料遞送CRISPR-Cas系統(tǒng) 136
8.1　引言 137
8.2　納米材料概述 137
8.2.1　納米材料定義及特性 137
8.2.2　納米材料的分類 138
8.2.3　納米材料的應用 138
8.3　基因療法簡介 139
8.4　納米材料遞載CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應用 140
8.4.1　二維納米材料遞送CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應用 140
8.4.2　貴金屬及自組裝納米材料遞載CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應用 143
8.4.3　其他納米材料遞載CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應用 145
8.5　結語 146
參考文獻 147

第9章　全基因組CRISPR-Cas9基因敲除和轉錄激活篩選的實驗方案 149
9.1　引言 150
9.2　實驗設計 151
9.2.1　篩選方法 151
9.2.2　sgRNA文庫的設計和選擇 151
9.2.3　構建和遞送sgRNA文庫的方法 152
9.2.4　選擇sgRNA 153
9.3　材料 155
9.3.1　試劑 155
9.3.2　耗材及設備 160
9.3.3　試劑制備 162
9.3.4　材料準備 164
9.3.5　步驟 164
9.4　結語 189
參考文獻 189

第10章　細菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其功能 191
10.1　引言 192
10.2　細菌中CRISPR的分布 193
10.3　CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌研究中的應用 194
10.3.1　對細菌基因組進行編輯 194
10.3.2　參與細菌基因的表達調控 195
10.3.3　與細菌生物膜、毒力和細菌耐藥的關系 196
10.3.4　參與細菌與宿主的相互作用 196
10.3.5　與細菌分型的關系 197
10.3.6　基于CRISPR系統(tǒng)的細菌進化分析 198
10.3.7　與核酸檢測的關系 198
10.4　CRISPR-Cas系統(tǒng)的應用可能帶來的倫理問題及有害影響 200
10.5　結語 201
參考文獻 201

第11章　CRISPR-Cas技術在抵抗病原微生物感染中的應用 206
11.1　引言 207
11.2　CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在病毒相關疾病治療中的應用 207
11.3　CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在細菌和真菌中的應用 208
11.4　結語 209
參考文獻 209

第12章　CRISPR-Cas9在免疫學研究中的應用 211
12.1　引言 212
12.2　CRISPR-Cas9在免疫相關疾病發(fā)病機制研究中的應用 212
12.2.1　造血系統(tǒng)惡性腫瘤疾病機制及動物模型研究 212
12.2.2　CRISPR-Cas9全基因組篩選用于研究復雜生命過程 213
12.3　CRISPR-Cas9在免疫相關疾病治療中的應用 214
12.3.1　腫瘤免疫治療 214
12.3.2　治療HIV感染 215
12.4　結語 217
參考文獻 218

第13章　CRISPR-Cas系統(tǒng)在核酸檢測中的應用 220
13.1　引言 221
13.2　基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測分類 222
13.2.1　基于Cas9系統(tǒng)的核酸檢測 222
13.2.2　基于CRISPR-Cas12和Cas14系統(tǒng)的DNA檢測 223
13.2.3　基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的RNA檢測 225
13.3　CRISPR-Cas核酸檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢及局限性 227
13.4　結語 227
參考文獻 228

第14章　CRISPR-Cas9在疾病治療中的應用 229
14.1　引言 230
14.2　CRISPR-Cas9系統(tǒng)在癌癥生物學中的潛在應用 230
14.3　CRISPR-Cas9在遺傳性疾病中的作用 231
14.4　CRISPR-Cas9在病毒性疾病中的作用 232
14.5　CRISPR-Cas9在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用 234
14.6　CRISPR-Cas9在過敏和免疫疾病中的作用 234
14.7　結語 235
參考文獻 236

第15章　CRISPR-Cas在傳染病檢測和治療中的應用 237
15.1　引言 238
15.2　CRISPR-Cas生物學 238
15.2.1　獲取間隔序列 239
15.2.2　crRNA生成 239
15.2.3　干擾 240
15.3　CRISPR-Cas9技術概述 242
15.3.1　CRISPR-Cas9基因工程 242
15.3.2　sgRNA文庫用于篩選基因型-表型 242
15.3.3　使用失活的Cas9調節(jié)基因轉錄 242
15.4　在傳染病中的應用 243
15.4.1　了解宿主與病原體的相互作用 243
15.4.2　在傳染病診斷中的應用 244
15.4.3　CRISPR-Cas在治療中的應用 246
15.5　結語 249
參考文獻 251